Το άρθρο προτείνει μια νέα τεχνολογία μικρορευστοειδούς τσιπ για την ανίχνευση πολλαπλών παθογόνων μικροοργανισμών γαρίδας. Η ερευνητική ομάδα ενσωμάτωσε την τεχνολογία πολλαπλών ενζύμων ισοθερμικής ταχείας ενίσχυσης νουκλεϊκού οξέος (MIRA) και μεθόδους ανίχνευσης φθορισμού σε πραγματικό χρόνο. Αυτό το μικρορευστοειδές τσιπ παρέχει μια γρήγορη, ευαίσθητη και αποτελεσματική λύση για επιτόπια ανίχνευση μεγάλων παθογόνων γαρίδας.
Ερευνητικό υπόβαθρο και σημασία
Η παγκόσμια γεωργική βιομηχανία γαρίδας είναι ένα από τα σημαντικότερα οικονομικά συστατικά της υδατοκαλλιέργειας, αλλά η βιομηχανία αντιμετωπίζει από καιρό απειλές από μια ποικιλία παθογόνων μικροοργανισμών. Αυτά τα παθογόνα οδηγούν συχνά σε μεγάλης κλίμακας θάνατο γαρίδων, επηρεάζοντας σοβαρά την παραγωγή και τα οικονομικά οφέλη. Συμπεριλαμβανομένης της οξείας νόσου ηπατοπαγκρεατικής νέκρωσης (AHPND), του ιού του συνδρόμου λευκού σημείου (WSSV), του μολυσματικού υποδερμικού και του ιού της αιματοποιητικής νέκρωσης (IHHNV), του κλάδου των αιμοκυττάρων των γαρίδας (shiv) και του enterohepaticus (eHP) κ.λπ.
Οι παραδοσιακές μέθοδοι ανίχνευσης παθογόνων, όπως η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (τεχνολογία PCR), έχουν υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα, αλλά είναι πολύπλοκες για να λειτουργούν, να διαρκέσουν πολύ και να βασίζονται στον εργαστηριακό εξοπλισμό. Αυτοί οι περιορισμοί καθιστούν την τεχνολογία PCR ακατάλληλη για ταχείες επιτόπιες δοκιμές. Η τεχνολογία MIRA έχει γίνει ένα εργαλείο μοριακής ανίχνευσης κατάλληλο για εφαρμογή επί τόπου λόγω των χαρακτηριστικών ταχείας ενίσχυσης υπό σταθερή θερμοκρασία και φυσιολογικής θερμοκρασίας.
Αρχή τεχνολογίας Mira
Η τεχνολογία ταχείας ενίσχυσης των σταθερών θερμοκρασιών πολλαπλών ενζύμων (τεχνολογία MIRA) είναι μια τεχνολογία ενίσχυσης σταθερής θερμοκρασίας που βασίζεται στη συνέργεια πολλαπλών λειτουργικών πρωτεϊνών σε θερμοκρασία δωματίου για να επιτευχθεί ταχεία ενίσχυση των νουκλεϊνικών οξέων. Πρόκειται για μια πραγματικά φορητή τεχνολογία ανίχνευσης ταχείας νουκλεϊκού οξέος. Σε σύγκριση με την PCR, η Mira έχει περισσότερα πλεονεκτήματα.
Σχεδιασμός και καινοτομία των μικρορευστών τσιπ
Σχηματικό διάγραμμα της πλατφόρμας ανίχνευσης RPA σε τσιπ για αρκετούς σημαντικούς παθογόνους μικροοργανισμούς γαρίδας
(Α) Δομή μικρορευστοειδούς τσιπ τύπου δίσκου. 1: Θάλαμος αντίδρασης. 2: βαλβίδα μπάλας. 3: θύρα εξάτμισης. 4: θύρα δειγματοληψίας.
(Β) Εξηγείται προβολή. 5: φιλμ σφράγισης θερμότητας. 6: υπόστρωμα τσιπ.
(Γ) Λεπτομερής διάταξη των έξι σετ εκκινητών εντός του τομέα. Κάθε σετ εκκινητών είναι προ-σταθερό σε ένα καθορισμένο θάλαμο αντίδρασης.
(Δ) Ολοκληρώστε τη διαδικασία λειτουργίας On-Chip RPA Platform.
Το άρθρο προτείνει ένα μικρορευστοειδές τσιπ ενσωματωμένο με την τεχνολογία MIRA για την ανίχνευση πολλαπλών παθογόνων μικροοργανισμών γαρίδας. Η τεχνολογία μικρορευστών μπορεί να ελέγχει τα υγρά μέσα στα κανάλια σε επίπεδο μικρών για ακριβή χειραγώγηση, επιτυγχάνοντας έτσι την αποτελεσματική και χαμηλού κόστους ανίχνευση πολλαπλών στόχων.
Το τσιπ έχει τα ακόλουθα βασικά χαρακτηριστικά σχεδιασμού:
● Φυγοκεντρικό μικρορευστό τσιπ
Το τσιπ υιοθετεί ένα σχεδιασμό φυγοκεντρικής κίνησης, χρησιμοποιώντας φυγοκεντρική δύναμη για να διανείμει ομοιόμορφα το δείγμα σε κάθε θάλαμο αντίδρασης. Αυτός ο σχεδιασμός απλοποιεί τη διαδικασία λειτουργίας και ο χειριστής μπορεί να ολοκληρώσει ολόκληρη την αντίδραση με απλή έγχυση του δείγματος.
● Ανίχνευση πολλαπλών στόχων
Το τσιπ είναι προ-ενσωματωμένο με τους βακτηριακούς τύπους που πρέπει να ανιχνευθούν: οξεία ηπατοπαγκρεατική νέκρωση (V-AHPND), ο ιός του συνδρόμου λευκού σημείου (WSSV), ο ιός μολυσματικής υποδοχής (IHHNV), ο αιμοκυττάρου γαρίδας (sHIV) και ο ιός της εντεροεπτίτιδας (EHP). ) Ανιχνευτές εκκινητών για πέντε παθογόνα. Αυτός ο σχεδιασμός μπορεί να ανιχνεύσει ταυτόχρονα έξι γονιδιακούς στόχους σε μία αντίδραση, επιτρέποντας την ταχεία διαλογή πολλαπλών παθογόνων.
● Ανίχνευση φθορισμού σε πραγματικό χρόνο
Η αντίδραση ενίσχυσης τεχνολογίας MIRA στο τσιπ συνδυάζεται με έναν ανιχνευτή φθορισμού, ο οποίος μπορεί να παρακολουθεί την πρόοδο της αντίδρασης ενίσχυσης σε πραγματικό χρόνο. Ο σχεδιασμός του ανιχνευτή επιτρέπει την απελευθέρωση του σήματος φθορισμού μόνο όταν δημιουργείται το προϊόν ενίσχυσης, επιτυγχάνοντας έτσι ταχεία και ευαίσθητη ποσοτική ανίχνευση.
● Σύστημα αντίδρασης χαμηλής συγκέντρωσης
Κάθε μονάδα αντίδρασης του τσιπ απαιτεί μόνο όγκο αντίδρασης 5 μΐ, γεγονός που μειώνει σημαντικά την κατανάλωση αντιδραστηρίου. Όταν εκτελείται ολόκληρο το σύστημα, μπορούν να επεξεργαστούν ταυτόχρονα έως και τέσσερα δείγματα και κάθε δείγμα μπορεί να ανιχνεύσει πέντε παθογόνα, βελτιώνοντας σημαντικά την αποτελεσματικότητα της ανίχνευσης.
Ευαισθησία, εξειδίκευση και επαναληψιμότητα
Η απόδοση του συστήματος τσιπ περιλαμβάνει την ανίχνευση συμμετρίας, συντονισμού και επαναληψιμότητας.
● Ευαισθησία
Τα πειραματικά αποτελέσματα δείχνουν ότι το τσιπ μπορεί να ανιχνεύσει αριθμούς αντιγράφων γονιδίων στόχου τόσο χαμηλά όσο 10 αντίγραφα/μL, με ευαισθησία που είναι συγκρίσιμη ή ακόμα υψηλότερη από τις παραδοσιακές μεθόδους PCR. Αυτή η υψηλή ευαισθησία διασφαλίζει ότι η τεχνολογία μπορεί να ανιχνεύσει πρώιμα μολυσμένα άτομα σε πρακτικές εφαρμογές, επιτρέποντας έτσι την έγκαιρη εξέταση των παθογόνων.
● Ειδικότητα
Το πείραμα διεξήγαγε δοκιμές διασταυρούμενης αντίδρασης σε μια ποικιλία παθογόνων μη στόχων και τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το τσιπ είναι ιδιαίτερα ειδικό για τα παθογόνα-στόχους και μπορεί να διακρίνει με ακρίβεια διάφορους τύπους παθογόνων. Όλες οι δοκιμές για την οξεία νόσος της ηπατοπαγκρεατικής νέκρωσης (V-AHPND), ο ιός του συνδρόμου λευκού σημείου (WSSV), η μολυσματική υποδερμική και η αιματοποιητική νέκρωση του ιού (IHHNV) μη ειδική ενίσχυση.
● Επαναληψιμότητα
Προκειμένου να αξιολογηθεί η σταθερότητα της μεθόδου, η ερευνητική ομάδα διεξήγαγε πολλαπλά επανειλημμένα πειράματα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο συντελεστής μεταβολής (τιμή CV) μεταξύ διαφορετικών πειραμάτων ήταν μικρότερος από 10%, δείχνοντας καλή πειραματική επαναληψιμότητα και συνέπεια.
Εφαρμογές και πλεονεκτήματα πεδίου
Ο σχεδιασμός της τεχνολογίας MIRA Microfluidic Chip του δίνει σημαντικά πλεονεκτήματα εφαρμογής πεδίου, ιδιαίτερα κατάλληλα για ταχεία ανίχνευση και παρακολούθηση των παθογόνων στην καλλιέργεια γαρίδας:
● Βολική διαδικασία λειτουργίας
Ολόκληρη η διαδικασία ανίχνευσης απαιτεί μόνο την έγχυση του δείγματος στο τσιπ και την έναρξη της συσκευής αντίδρασης. Δεν απαιτεί σχεδόν καμία χειροκίνητη λειτουργία και είναι κατάλληλο για μη επαγγελματίες να χρησιμοποιούν στον ιστότοπο.
● Δυνατότητα γρήγορης απόκρισης
Το σύστημα μπορεί να αποκτήσει αποτελέσματα δοκιμών εντός 20 λεπτών, μειώνοντας σημαντικά τον χρόνο δοκιμής. Αυτό είναι ζωτικής σημασίας για την ταχεία αντίδραση της νόσου στις εκμεταλλεύσεις και τη μείωση της εξάπλωσης των παθογόνων.
● Δυνατότητα ανίχνευσης πολλαπλών
Πέντε σημαντικά παθογόνα μπορούν να εντοπιστούν σε μία δοκιμή, η οποία βελτιώνει σημαντικά την αποτελεσματικότητα της ανίχνευσης και εξοικονομεί το κόστος ανίχνευσης και το χρόνο.
Προοπτικές τεχνολογίας Mira
Παρόλο που η τεχνολογία PCR έχει αξιολογηθεί από καιρό ως το χρυσό πρότυπο για την ανίχνευση ενίσχυσης νουκλεϊκού οξέος, η τεχνολογία MIRA έχει επιδείξει μεγάλο δυναμικό εφαρμογής λόγω της ταχείας αντίδρασής της σε σταθερή θερμοκρασία, απλή λειτουργία και απαιτήσεις χαμηλού εξοπλισμού. Με τη σύγκριση με την PCR σε συνδυασμό με την αλληλουχία του DNA, διαπιστώθηκε ότι τα αποτελέσματα ανίχνευσης του τσιπ ισοθερμικής ενίσχυσης είναι συνεπείς με την PCR που προκύπτουν από την άποψη της ευαισθησίας και της ειδικότητας και ο χρόνος αντίδρασης της τεχνολογίας MIRA μειώνεται σημαντικά. Ως εκ τούτου, η τεχνολογία MIRA Microfluidic τσιπ θεωρείται μια τεχνολογία πιο κατάλληλη για εφαρμογές πεδίου, ειδικά σε περιβάλλοντα που απαιτούν ταχεία και μεγάλης κλίμακας ανίχνευση παθογόνων.
Τα μικρορευστοειδή τσιπ βασισμένα σε τεχνολογία πολλαπλών ενζύμων ισοθερμικής ταχείας ενίσχυσης νουκλεϊκού οξέος (MIRA) παρέχουν ένα αποτελεσματικό εργαλείο για την ανίχνευση παθογόνων μικροοργανισμών στη γεωργία γαρίδας. Αυτή η τεχνολογία έχει τα πλεονεκτήματα της υψηλής ευαισθησίας, της καλής ειδικότητας, της εύκολης λειτουργίας και της ταχύτητας ταχείας ανίχνευσης και έχει ευρείες προοπτικές εφαρμογής στην πρόληψη και τον έλεγχο της νόσου της υδατοκαλλιέργειας. Με περαιτέρω ανάπτυξη και βελτιστοποίηση της τεχνολογίας, το σύστημα αναμένεται να εφαρμοστεί στην ανίχνευση περισσότερων υδάτινων παθογόνων, επιτρέποντας την ευρύτερη πρόληψη και παρακολούθηση της νόσου.
Τα αποτελέσματα της έρευνας παρέχουν μια αξιόπιστη μέθοδο έγκαιρης ανίχνευσης για τη βιομηχανία υδατοκαλλιέργειας, η οποία μπορεί να μειώσει αποτελεσματικά τον κίνδυνο των εστιατορίων της νόσου, να βελτιώσει την αποδοτικότητα και την παραγωγή των εκμεταλλεύσεων και να θέσει ένα τεχνικό υπόβαθρο για την αειφόρο ανάπτυξη της βιομηχανίας υδατοκαλλιέργειας.