Το Aeromonas hydrophila είναι ένα σημαντικό παθογόνο βακτήριο στην υδατοκαλλιέργεια, που προκαλεί σοβαρές ασθένειες στα εκτρεφόμενα ζώα και έχει ως αποτέλεσμα σημαντικές οικονομικές απώλειες. Για να επιτρέψουμε την ταχεία ανίχνευση-στον ιστότοπο, αναπτύξαμε μια φορητή πλατφόρμα μικρορευστών που ενσωματώνει την ταχεία ισοθερμική ενίσχυση πολλαπλών-ενζύμων (MIRA) με αυτοματοποιημένο χειρισμό υγρών. Ο σχεδιασμός του τσιπ ενσωματώνει έναν μικροσκοπικό κινητήρα δόνησης και κεραμικά μαξιλάρια θέρμανσης για συντήρηση
ακριβής έλεγχος θερμοκρασίας και διασφάλιση της ομοιογένειας της αντίδρασης σε όλη την εκχύλιση και την ενίσχυση νουκλεϊκού οξέος. Μια μινιατούρα αντλία αέρα οδήγησε το ακατέργαστο εκχύλισμα DNA μέσα από το τσιπ σε ένα μόνο βήμα με πιπέτα για ακρίβειαποσοτικοποίηση. Το εξαγόμενο DNA στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε θάλαμο αντίδρασης προφορτισμένο με MIRAαντιδραστήρια για ισοθερμική ενίσχυση στις 39 μοίρες υπό παρακολούθηση-φθορισμού πραγματικού χρόνου. Αυτή η πλατφόρμα εντοπίστηκε
A. hydrophila σε δείγματα νερού εντός 40 λεπτών, επιτυγχάνοντας γραμμικό εύρος από 1 × 10² έως 1 × 107 CFU⋅mL−1και όριο ανίχνευσης (LOD) 10 CFU⋅mL−1. Συγκεκριμένα, ο αρθρωτός σχεδιασμός του επιτρέπει την εύκολη εναλλαγή εκκινητών και ανιχνευτών, καθιστώντας την πλατφόρμα εύκολα προσαρμόσιμη για την ανίχνευση διαφόρων βακτηριακών παθογόνων στην υδατοκαλλιέργεια.
Σχηματική σύγκριση της φορητής πλατφόρμας μικρορευστών και της συμβατικής πλατφόρμας ανίχνευσης για το A. hydrophila. (Α) Το φορητό μικρορευστό
πλατφόρμα. Η ροή εργασιών ανίχνευσης σε αυτήν την πλατφόρμα ενσωματώνει την εκχύλιση νουκλεϊκού οξέος, την ακριβή μεταφορά με πιπέτα, την ενίσχυση και την ανίχνευση. (Β) Η συμβατική πλατφόρμα ανίχνευσης. Η συμβατική ροή εργασίας-που βασίζεται σε εργαστήριο βασίζεται σε εξελιγμένο εξοπλισμό, εκπαιδευμένο προσωπικό και χρονικά-εντατικές διαδικασίες.
Αξιολόγηση ευστάθειας της φορητής πλατφόρμας μικρορευστών. (Α) Φωτογραφία της φορητής πλατφόρμας μικρορευστών. (Β, Γ) Θερμική απόδοση των θαλάμων εκχύλισης και ανίχνευσης νουκλεϊκού οξέος. Σχέση μεταξύ κεραμικού θερμαντικού μαξιλαριού και θερμοκρασίας θαλάμου. (Δ) Σταθερότητα ανίχνευσης φθορισμού (N=3). Η ένταση του φθορισμού μετρήθηκε σε διαστήματα 5 λεπτών καθ' όλη τη διάρκεια της διαδικασίας ενίσχυσης.
Αξιολόγηση απόδοσης της φορητής πλατφόρμας μικρορευστών. (Α) Καμπύλη βαθμονόμησης για ανίχνευση A. hydrophila (N=3). Δημιουργήθηκε μια καμπύλη βαθμονόμησης ανιχνεύοντας το A. hydrophila σε ένα εύρος συγκεντρώσεων 1 × 101 – 1 × 108 CFU⋅mL−1κάτω από βέλτιστες συνθήκες. (Β) Αξιολόγηση αναπαραγωγιμότητας από τσιπ-σε-τσιπ. Ο προσδιορισμός MIRA για το A. hydrophila πραγματοποιήθηκε σε δέκα τσιπ κατασκευασμένα από καθένα από δύο ανεξάρτητα καλούπια. (Γ) Ανάλυση ειδικότητας (N=3). Η ειδικότητα της ανάλυσης MIRA επικυρώθηκε έναντι του στόχου A. hydrophila και 11 μη{10}}ειδών βακτηρίων-στόχων. (Δ) Σύγκριση με qPCR (N=3). Τόσο η πλατφόρμα όσο και η qPCR χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση του A. hydrophila σε διάφορες συγκεντρώσεις. (Ε) Ανίχνευση πεδίων-απομονωμένων στελεχών (N=3). Τέσσερα απομονωμένα στελέχη του A. hydrophila σε πεδίο{19}}ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας τόσο την πλατφόρμα όσο και το qPCR.