《Ανάπτυξη ενός νέου CAS13A/CAS12A μεσολαβούμενη"One Pot" διπλό Δοκιμασία ανίχνευσης για γενετικά τροποποιημένες καλλιέργειες Express
Οι γενετικά τροποποιημένες καλλιέργειες έχουν φυτευτεί ευρέως σε όλο τον κόσμο και πολλές χώρες έχουν βελτιώσει σταδιακά τα ρυθμιστικά μέτρα τους για να εξασφαλίσουν την ασφάλεια των γενετικά τροποποιημένων καλλιεργειών. Η ανάπτυξη ταχείας και ακριβούς μεθόδων γενετικής ανίχνευσης είναι πολύ σημαντική για τη γεωργία και τη βιοασφάλεια και μπορεί να ανακουφίσει τις ανησυχίες του κοινού για γενετικά τροποποιημένα προϊόντα.
Σε αυτή τη μελέτη, η ερευνητική ομάδα ανέπτυξε μια νέα αντίδραση ενός δοχείου -- Dual ανίχνευση MIRA σε συνδυασμό με τη διπλή CRISPR (MR-DCA μέθοδο) για την ταυτόχρονη ανίχνευση των γενετικών στόχων CAMV35S και NOS σε γενετικά τροποποιημένες καλλιέργειες, παρέχοντας μια απλή και αποτελεσματική μέθοδο ανίχνευσης για την ανίχνευση γενετικά τροποποιημένων καλλιεργειών.
Πειραματικές μέθοδοι
Το διπλό προϊόν MIRA αναλύεται από το διπλό σύστημα CAS13A και CAS12A για τη δημιουργία δύο ανεξάρτητων σημάτων που δεν παρεμβαίνουν μεταξύ τους και στη συνέχεια το φθορίζον χρώμα διαβάζεται από ένα όργανο φωτισμού ή από μια δοκιμαστική λωρίδα με δύο γραμμές Τ για να επιτύχει ανάγνωση διπλής καναλιού. Ολόκληρη η διαδικασία ολοκληρώνεται σε λιγότερο από 35 λεπτά, με όριο ανίχνευσης μόλις 20 αντίτυπα.
(Αρχή της ανίχνευσης MR-DCA των CAMV35S και NOS)
Ολόκληρο το πείραμα χωρίζεται σε τρία βήματα: ενίσχυση MIRA, αντίδραση CRISPR και δύο μέθοδοι ερμηνείας αποτελεσμάτων.
Το γονίδιο CAMV35S χρησιμοποιείται ως στόχος του Cas13a και το γονίδιο NOS χρησιμοποιείται ως στόχος του Cas12a. Δύο ζεύγη εκκινητών Mira σχεδιάστηκαν αντίστοιχα. Το σύστημα CAS13A αναγνωρίζει μόνο το RNA, έτσι ώστε να έχει σχεδιαστεί η περιοχή του προωθητικού εκκινητή, η οποία περιέχει έναν προαγωγό Τ7 για επακόλουθη μεταγραφή και ενεργοποίηση του Cas13a. Ένα PAM προστίθεται στο γονίδιο των nos. Οι παραπάνω προσθήκες εξασφαλίζουν ότι τόσο οι πρωτεΐνες CAS13A όσο και Cas12a μπορούν να δεσμευτούν με τα αντίστοιχα CRRNAs τους και δεν υπάρχει παρεμβολή ή διασταυρούμενη αντίδραση μεταξύ των δύο συστημάτων.
Πειραματική κατάσταση
Ευαισθησία και εξειδίκευση
Το δείγμα αραιώθηκε σε βαθμίδα για να δοκιμαστεί η ένταση φθορισμού της αντίδρασης MIRA. Διαπιστώθηκε ότι η ένταση φθορισμού θα μπορούσε να ανιχνευθεί σε συγκέντρωση δείγματος 20 μΐ. Η συγκέντρωση 20 μΐ επιλέχθηκε τελικά για το πείραμα.
(Διαφορετικές συγκεντρώσεις δείγματος και δοκιμαστικές λωρίδες χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό της ανάπτυξης χρώματος και της έντασης)
Για να αξιολογηθεί περαιτέρω η εξειδίκευση του MR-DCA, η ερευνητική ομάδα εξέτασε μικτά δείγματα μη διαγονιδιακών ζώων και μη διαγονιδιακών φυτών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μόνο διαγονιδιακά δείγματα που περιείχαν CAMV35s και NOS είχαν υψηλά σήματα φθορισμού, ενώ η ένταση φθορισμού άλλων δειγμάτων ήταν κοντά σε εκείνη του αρνητικού ελέγχου. Το MR-DCA μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως συγκεκριμένη πλατφόρμα ανίχνευσης νουκλεϊκού οξέος διπλού στόχου.
24 δείγματα καλλιέργειας δοκιμάστηκαν από MR-DCA. Μεταξύ αυτών, 1, 2, 15, 16, 21 και 22 είναι διαγονιδιακό καλαμπόκι που περιέχει CAMV35S υποκινητής. 7, 8, 23 και 24 είναι διαγονιδιακό ρύζι ανθεκτικό στη νόσο που περιέχει NOS Terminator. 3, 4, 11, 12, 13, 14, 17 και 18 είναι διαγονιδιακές σόγια που περιέχουν CAMV35S υποκινητής και NOS Terminator.
(Αποτελέσματα δοκιμών 24 δειγμάτων)
Ταχεία αντίδραση
Ο χρόνος αντίδρασης είναι ένας σημαντικός παράγοντας στην ανίχνευση επιτόπου. Η ερευνητική ομάδα παρατήρησε ότι τα σήματα φθορισμού των FAM και HEX θα μπορούσαν να ανιχνευθούν με όργανο φθορισμού όταν ο χρόνος αντίδρασης ήταν 10 λεπτά. Η Mira σε συνδυασμό με την αντίδραση CRISPR παρατηρήθηκε επίσης κίτρινος φθορισμός μετά από 15 λεπτά.
(Σήμα φθορισμού σε διαφορετικούς χρόνους αντίδρασης MIRA)
(Η ανάπτυξη χρώματος των δοκιμαστικών λωρίδων σε διαφορετικούς χρόνους αντίδρασης MIRA και τον υπολογισμό της ποσοτικοποίησης έντασης)
Πειραματικό συμπέρασμα
Τα πειραματικά αποτελέσματα έδειξαν ότι το διπλό MIRA έχει καλή εξειδίκευση και μπορεί να αποκτήσει με ακρίβεια τα προϊόντα ενίσχυσης των CAMV35s και NOS. Τα συστήματα CAS13A και CAS12A αντιδρούν ανεξάρτητα χωρίς να παρεμβαίνουν μεταξύ τους. Η δοκιμή MR-DCA μπορεί να ανιχνεύσει με ακρίβεια 20 αντίγραφα σε χαμηλή θερμοκρασία 35 λεπτών, η οποία έχει μεγάλη αξία στην ανίχνευση γενετικά τροποποιημένων καλλιεργειών στον τομέα.
Πληροφορίες άρθρου
Όνομα περιοδικού: 《Journal of Advanced Research Express
Τίτλος άρθρου: 《Ανάπτυξη ενός νέου προσδιορισμού διπλής ανίχνευσης CAS13A/CAS12A
Παράγοντας αντίκτυπου: 11.4
Ερευνητική ομάδα: Wang Xiaofu, Zhejiang Ακαδημία Γεωργικών Επιστημών