Οι γαρίδες χόρτου είναι ένα σημαντικό οικονομικό είδος στη βιομηχανία υδατοκαλλιέργειας γλυκού νερού της Κίνας. Ωστόσο, τα τελευταία χρόνια, τοΗπατοπαγγρετικό μικροσπορίδιο(EHP), ένα παράσιτο που μολύνει το ηπατοπάνες της γαρίδας, έχει επηρεάσει σοβαρά τη βιομηχανία. Δεδομένου ότι δεν υπάρχει επί του παρόντος αποτελεσματικό φάρμακο ή εμβόλιο για τη θεραπεία αυτής της ασθένειας, η ταχεία και ακριβής ανίχνευση είναι ζωτικής σημασίας για την πρόληψη της εξάπλωσής του.
A.magnified 9. 0 × 1 0 3 φορές; Β. Μέγιστο 5.0 × 104 φορές.
Qiao Yi, Shen Hui, Wan Xihe, Fan Xianping, Jiang Ge, Li Hui, Wang Libao, Shi Wenjun, Cheng Jie. Η απομόνωση και η μορφολογική παρατήρηση του ηπατοπαγκρεατικού μικροσπορίδιο στο Litopenaeus vannamei. Journal of Fishery Sciences της Κίνας, 2018, 25 (5): 1051-1058. Doi: 10.3724/sp.j.1118.2018.17430.
Η ανίχνευση του EHP βασίζεται κυρίως σε μεθόδους μοριακής βιολογίας, με την πιο συνηθισμένη τεχνολογία PCR. Ωστόσο, ενώ η PCR προσφέρει υψηλή ευαισθησία, απαιτεί ακριβό εξοπλισμό PCR και εξειδικευμένο εργαστηριακό περιβάλλον, καθιστώντας το ακατάλληλο για χρήση στον τομέα. Για να αντιμετωπιστεί αυτό το ζήτημα, η ερευνητική ομάδα ανέπτυξε δύο μεθόδους ταχείας ανίχνευσης με βάση την τεχνολογία MIRA. Αυτές οι μέθοδοι προσφέρουν υψηλή ευαισθησία, γρήγορη ανταπόκριση και εύκολη λειτουργία, επιτρέποντας την αποτελεσματική και ταχεία ανίχνευση του EHP σε γαρίδες στο χώρο χωρίς την ανάγκη για πολύπλοκο εργαστηριακό εξοπλισμό, γεμίζοντας έτσι το χάσμα στις μεθόδους ανίχνευσης ρεύματος.
Αντιδραστήρια ενίσχυσης που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη:
- ΫΝΑ ισοθερμικό κιτ ταχείας ενίσχυσης (βασικό)
- ΫΝΑ ισοθερμικό κιτ ταχείας ενίσχυσης (τύπος κολλοειδούς χρυσού)
Η τεχνολογία MIRA είναι μια μέθοδος πολλαπλών ενζύμων ισοθερμικής ταχείας νουκλεϊκού οξέος. Η βασική του αρχή περιλαμβάνει τη συντονισμένη δράση πολλαπλών λειτουργικών πρωτεϊνών σε θερμοκρασίες περιβάλλοντος για την επίτευξη ταχείας ενίσχυσης του νουκλεϊκού οξέος, επιτρέποντας πραγματικά φορητή, επιτόπια ανίχνευση νουκλεϊκού οξέος.
Μέθοδοι έρευνας
Εκχύλιση δείγματος
Η ερευνητική ομάδα συνέλεξε τόσο τα μολυσμένα όσο και τα υγιή δείγματα γαρίδας από τρεις εκμεταλλεύσεις γαρίδας στην επαρχία Liaoning, εξάγοντας DNA από το ηπατοπάγκο της γαρίδας.
Σχεδιασμός εκκινητών
Τρία σύνολα εκκινητών MIRA σχεδιάστηκαν στοχεύοντας στο γονίδιο πρωτεΐνης S8 σερίνης του EHP (αριθμός εισαγωγής GenBank: το 182063). Αυτό το γονίδιο έχει μοναδικές ενεργές θέσεις, εξασφαλίζοντας την εξειδίκευση της ανίχνευσης.
Ανίχνευση Mira-AGE και MIRA-LFD
(Α) Βελτιστοποιημένες θερμοκρασίες αντίδρασης RPA-AGE. Μ: δείκτης DL 500. Ν: αρνητικός έλεγχος. Στελέχη 1-5: 25 μοίρες, 30 μοίρες, 37 μοίρες, 39 μοίρες και 42 μοίρες.
(Β) Βελτιστοποιημένοι χρόνοι αντίδρασης RPA-AGE. Μ: δείκτης DL 500. Ν: αρνητικός έλεγχος. 1: 10 λεπτά. 2: 20 λεπτά. 3: 30 λεπτά. 4: 40 λεπτά.
(Γ) Βελτιστοποιημένες θερμοκρασίες αντίδρασης RPA-LFD. Ν: αρνητικός έλεγχος. 1: 25 μοίρες. 2: 30 μοίρες. 3: 37 βαθμοί. 4: 39 βαθμοί. 5: 42 βαθμοί.
(Δ) Βελτιστοποιημένοι χρόνοι αντίδρασης RPA-LFD. Ν: αρνητικός έλεγχος. 1: 5 λεπτά. 2: 10 λεπτά. 3: 20 λεπτά.
Οι δύο μέθοδοι ανίχνευσης MIRA, η ηλεκτροφόρηση MIRA-AGE (ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης) και η MIRA-LFD (κολλοειδές χρυσό πλευρική ανοσοδοκιμασία) χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση EHP. Η ερευνητική ομάδα βελτιστοποίησε τις θερμοκρασίες και τους χρόνους αντίδρασης μέσω πειραματισμού. Η MIRA-AGE ενίσχυσε το DNA στόχο σε 30 λεπτά σε 37 μοίρες, ενώ η MIRA-LFD ολοκλήρωσε την ενίσχυση σε μόλις 10 λεπτά σε 37 μοίρες, με αποτελέσματα ευανάγνωστα μέσα σε 5 λεπτά.
Πειραματικά αποτελέσματα
Εξειδίκευση και ευαισθησία
(Α) Ειδικότητα της ανίχνευσης RPA-AGE. Μ: δείκτης DL 1000. Ρ: Nosema Bombycis. 1: EHP; 2: encephalitozoon. 3: Microsporidia; 4: ιός συνδρόμου λευκού σημείου. 6: μη φυσιολογική. Ν: αρνητικός έλεγχος.
(Β) Ειδικότητα της ανίχνευσης RPA-LFD. Ρ: Nosema Bombycis. Ν: αρνητικός έλεγχος. 1: EHP; 2: encephalitozoon. 3: Microsporidia; 4: ιός συνδρόμου λευκού σημείου. 6: Μη φυσιολογική.
(Γ) Η ευαισθησία του RPA-AGE με αραιώσεις κλίσης των ανασυνδυασμένων πλασμιδίων. Μ: δείκτης DL 500. Ν: αρνητικός έλεγχος. 1: 4.7 × 10^5 αντίγραφα/μL. 2: 4.7 × 10^4 αντίγραφα/μL. 3: 4.7 × 10^3 αντίγραφα/μL. 4: 4.7 × 10^2 αντίγραφα/μL. 5: 4.7 αντίγραφα/μL. 6: 4.7 αντίγραφα/μL.
(Δ) Η ευαισθησία του RPA-LFD με αραιώσεις κλίσης των ανασυνδυασμένων πλασμιδίων. Ν: αρνητικός έλεγχος. 1: 4.7 × 10^5 αντίγραφα/μL. 2: 4.7 × 10^4 αντίγραφα/μL. 3: 4.7 × 10^3 αντίγραφα/μL. 4: 4.7 × 10^2 αντίγραφα/μL. 5: 4.7 αντίγραφα/μL. και 6: 4.7 αντίγραφα/μL.
Τα πειράματα κατέδειξαν ότι η τεχνολογία MIRA έχει υψηλή εξειδίκευση, ανιχνεύοντας με ακρίβεια το EHP χωρίς να αντιδράει σε άλλα παθογόνα. Από την άποψη της ευαισθησίας, και οι δύο μέθοδοι είχαν ένα όριο ανίχνευσης 4,7 αντιγράφων/μL, σημαντικά υψηλότερο από την ευαισθησία της παραδοσιακής PCR.
Δοκιμή κλινικών δειγμάτων
Τα αποτελέσματα από τη δοκιμή 30 κλινικών δειγμάτων έδειξαν ότι η MIRA-AGE και η MIRA-LFD είχαν ποσοστό θετικότητας 70%, ελαφρώς χαμηλότερο από το 80%της QPCR, αλλά σημαντικά υψηλότερο από το 56,7%της παραδοσιακής PCR.
Προοπτικές εφαρμογής
Οι μέθοδοι ανίχνευσης που βασίζονται σε MIRA επιτρέπουν την ταχεία ενίσχυση των γονιδίων στόχων σε σταθερές θερμοκρασίες. Συγκεκριμένα, η μέθοδος MIRA-LFD μπορεί να προσφέρει αποτελέσματα σε μόλις 10 λεπτά χωρίς την ανάγκη για πολύπλοκο εργαστηριακό εξοπλισμό, καθιστώντας το ιδανικό για επιτόπια χρήση σε εκμεταλλεύσεις γαρίδας. Η υψηλή ευαισθησία και η εξειδίκευση αυτής της τεχνολογίας καθιστά ένα αποτελεσματικό εργαλείο για την έγκαιρη ανίχνευση και τον έλεγχο της EHP, προστατεύοντας έτσι την υγεία και την ανάπτυξη της βιομηχανίας γεωργικών γαρίδων.
Μεταξύ αυτών των μεθόδων, η ανοσοπροσδιορισμού της κολλοειδούς πλευρικής ροής (MIRA-LFD) είναι ιδιαίτερα κατάλληλη για εφαρμογές επιτόπου λόγω της απλότητας και των διαισθητικών αποτελεσμάτων του. Οι αγρότες γαρίδας χόρτου μπορούν να ανιχνεύσουν και να ανταποκριθούν γρήγορα στις λοιμώξεις EHP, στη βελτίωση των δυνατοτήτων ελέγχου της νόσου, στην σημαντική ενίσχυση της αποτελεσματικότητας της γεωργίας και στη μείωση των οικονομικών απωλειών.