Το Staphylococcus haemolyticus είναι ένα θετικό Gram-θετικό-αρνητικό βακτήριο που είναι πολύ συνηθισμένο στα νοσοκομεία. Τα τελευταία χρόνια, υπήρξε αυξανόμενη ανησυχία λόγω του υψηλού κινδύνου λοιμώξεων που έχουν αποκτηθεί από νοσοκομείο. Το Staphylococcus haemolyticus μπορεί να προκαλέσει περαιτέρω λοιμώξεις από το δέρμα, μηνιγγίτιδα, περιτονίτιδα και ακόμη και σήψη. Οι καθυστερήσεις στην κλινική διάγνωση μπορούν να οδηγήσουν σε επιδείνωση των συνθηκών υγείας, οπότε η ταχεία διάγνωση του Staphylococcus haemolyticus είναι το κλειδί για την ακριβή θεραπεία.
Η ερευνητική ομάδα του καθηγητή Ji Tuo από το Τμήμα Κεντρικού Εργαστηρίου του Lianyungang Δεύτερη Λαϊκή Νοσοκομείο δημοσίευσε ένα άρθρο "γρήγορη και οπτική ανίχνευση του Staphylococcus haemolyticus σε κλινικά δείγματα με MIRA-LF" στο περιοδικό "Analytica Chimica Acta", με παράγοντα αντίκτυπου 6.2.
Επισκόπηση της μελέτης
Σε αυτή τη μελέτη, η ομάδα του καθηγητή Ji Tuo καθιέρωσε μια μέθοδο για την ανίχνευση του Staphylyticus haemolyticus με MIRA-LF που βασίζεται στο γονίδιο MVAA και χρησιμοποίησε την τεχνολογία πολλαπλών ενζυμικών σταθερής θερμοκρασίας ταχείας ενίσχυσης νουκλεϊνικού οξέος MIRA σε συνδυασμό με τη λωρίδα LFS με ταχεία ανίχνευση παθογόνων. Το πείραμα πραγματοποιήθηκε σε 37 βαθμούς και τα αποτελέσματα ανιχνεύθηκαν εντός 9 λεπτών με ευαισθησία ανίχνευσης 0. 147 CFU/αντίδραση. Η μέθοδος ανίχνευσης MIRA-LFS είναι κατάλληλη για την ανίχνευση σταθερού σημείου του Staphylococcus haemolyticus σε κλινικά δείγματα και συνειδητοποιεί τη μέθοδο αναγνώρισης του Staphylococcus haemolyticus από το POCT, η οποία έχει μεγάλη αξία για την ταχεία διάγνωση και τη θεραπεία των ασθενειών σε περιοχές που υποβλήθηκαν. Η ερευνητική ομάδα χρησιμοποίησε MIRA-LFS, qPCR και παραδοσιακές μεθόδους βακτηριακής καλλιέργειας για να αναλύσει 95 τυχαία κλινικά δείγματα και επιβεβαίωσε την κλινική εφαρμογή.
Μέθοδοι έρευνας
Ένα σχηματικό διάγραμμα της δοκιμής MIRA-LFS παρουσιάζεται παραπάνω. Σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν, χρησιμοποιήθηκαν το κιτ ταχείας ενίσχυσης της σταθερής θερμοκρασίας AMPFUTURE Biotech (τύπος δοκιμής κολλοειδούς χρυσού) και η ταινία δοκιμής ανίχνευσης νουκλεϊκού οξέος.
Το μήκος του εκκινητή του γονιδίου MVAA ήταν 30-35 νουκλεοτίδια και το μήκος του προϊόντος ενίσχυσης ήταν 100-350 BP και σχεδιάστηκαν συνολικά 6 ζεύγη υποψήφιων εκκινητών. Το gDNA των τυποποιημένων στελεχών Staphylytic Staphylococcus χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση MIRA, υποβλήθηκαν σε εξετάσεις υποψήφιων εκκινητών και τα ενισχυμένα προϊόντα απεικονίστηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης 2%.
(Τα προϊόντα ενίσχυσης εμφανίζονται χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης)
Στη συνέχεια, ο ανιχνευτής σχεδιάζεται σύμφωνα με την ακολουθία του εκκινητή προς τα εμπρός (16 bp προς τα πίσω). Το 5 'άκρο του ανιχνευτή επισημαίνεται με FITC και το 3' άκρο επισημαίνεται C3. Το νουκλεοτίδιο θέσης 31- στον ανιχνευτή αντικαθίσταται με THF σε απόσταση 30 bp από το άκρο των 5 'και 15 bp από το τέλος 3'. Το 5 'άκρο του επιλεγμένου αντίστροφου αστάρι επισημαίνεται με βιοτίνη.
(Σχηματικό διάγραμμα διαταραχής και τροποποίησης αλληλουχίας συνδυασμών εκκινητή-προστασίας)
Επιπλέον, οι συνθήκες αντίδρασης για την ανίχνευση του MIRA-LFs από το Staphylococcus haemolyticus βελτιστοποιήθηκαν. Οι δοκιμές εκτελούνται σε 37 μοίρες από 4-12 min σε διαστήματα 2 λεπτών. Τα αποτελέσματα εμφανίζονται στον χρόνο αντίδρασης των 8 λεπτών και η γραμμή δοκιμής είναι σαφώς ορατή. Επιπλέον, η δοκιμή εκτελείται από 22-52 βαθμό σε διαστήματα 5 μοιρών. 37-42 Το βαθμό είναι η καταλληλότερη θερμοκρασία για την ανίχνευση MIRA-LFS. Επομένως, ο βέλτιστος χρόνος αντίδρασης και θερμοκρασία της μεθόδου MIRA-LFS για το Staphylococcus haemolyticus ήταν 8 λεπτά και 37 βαθμοί αντίστοιχα. Μαζί με το γεγονός ότι το τελικό αποτέλεσμα απεικονίζεται από το LFS εντός 1 λεπτού, ο συνολικός χρόνος ανίχνευσης είναι 9 λεπτά.
(Βελτιστοποίηση του χρόνου αντίδρασης και της θερμοκρασίας)
Πειραματικά αποτελέσματα
1. Επαλήθευση ευαισθησίας
Διαφορετικές συγκεντρώσεις γονιδιωματικού ϋΝΑ (gDNA) που ελήφθησαν από σειριακές αραιώσεις των καλλιεργειών Staphylococcus haemolytica (1 {{2}^^6-10^0 cfu/ml) δοκιμάστηκαν για mira-lfs.
(Θετικό σήμα σε διαφορετικές συγκεντρώσεις)
Η πιθανή ανάλυση παλινδρόμησης μονάδας έδειξε ότι η LOD 95% που προσδιορίστηκε με τη δοκιμασία MIRA-LFS ήταν 0. 147CFU/αντίδραση.
(Όριο υπολογισμού ανίχνευσης)
2. Επικύρωση εξειδίκευσης
Η εκλεκτικότητα της ανίχνευσης MIRA-LFS προσδιορίστηκε με ανάλυση 18 στελεχών κοινών παθογόνων μικροοργανισμών και 15 στελέχη κλινικών σταφυλόκοκκων haemolyticus. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η δοκιμή MIRA-LFS ήταν αρνητική και για τα 18 άλλα παθογόνα βακτήρια και θετικά για 15 επαληθευμένα κλινικά δείγματα Staphylococcus haemolyticus.
(8 στελέχη τυπικών παθογόνων βακτηρίων και 15 στελέχη κλινικής αιμολυτικής στρεπτόκοκκου δοκιμάστηκαν, αντίστοιχα)
Η δοκιμασία MIRA-LFS έχει υψηλή εκλεκτικότητα και είναι κατάλληλη για την εξέταση του Staphylococcus haemolyticus.
3. Πραγματική δοκιμή δείγματος
Συνολικά 95 δείγματα συλλέχθηκαν τυχαία από το νοσοκομείο Lianyungang Second People, συμπεριλαμβανομένων 35 δειγμάτων δέρματος και μαλακού ιστού, 16 δείγματα ούρων, 14 δείγματα πτυέλων και 30 δείγματα αίματος.
(95 κλινικά δείγματα δοκιμάστηκαν με διαφορετικές μεθόδους)
Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μέθοδος ανίχνευσης ήταν 100% σύμφωνη με τη μέθοδο qPCR. Επιπλέον, σε σύγκριση με το χρυσό πρότυπο (GB/T4789. 11-2003), η ευαισθησία και η εξειδίκευση της δοκιμασίας MIRA-LFS για την ταυτοποίηση της λοίμωξης Staphylococcus haemolytica ήταν 100% και 98,73% αντίστοιχα. Αυτά τα αποτελέσματα επικυρώνουν περαιτέρω την τεχνική σκοπιμότητα της μεθόδου στην ανίχνευση του Staphylococcus haemolyticus σε κλινικά δείγματα.
Η μέθοδος MIRA-LFS χρησιμοποιείται για την ταχεία ανίχνευση του Staphylococcus haemolyticus από το POCT, το οποίο είναι αποτελεσματικό, ακριβές, απλό και οικονομικά αποδοτικό, το οποίο είναι χρήσιμο για την ταχεία διάγνωση και τις αποφάσεις θεραπείας.